非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为一种慢性肝病，主要是在无酒精消耗情况下肝脏中发生脂肪沉积或变性现象，在脂肪沉积、氧化应激以及肝脏慢性炎症的作用下，NAFLD可能会发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，还可能发展为肝硬化。高脂饮食以及缺乏运动是患NAFLD的主要病因，改变生活方式及减肥可缓解NAFLD，同时有越来越多的研究表明，肠道微生物可以参与肝脏中相关因子的代谢；双歧杆菌与蓝莓同食可以减轻NAFLD大鼠脂肪的沉积。故本实验建立高脂饮食(HFD)大鼠模型，探究乳双歧杆菌V9对NAFLD的缓解作用。
实验设计
实验详情
1.实验对象
选取40只健康大鼠作为实验材料进行为期4周的实验，随机分为五组，分别为：对照组、HFD组、HFD+Berberine组、V9治疗组(HFD/V9)和V9对照组(CON/V9)，每组各8只大鼠。
2.实验方法
其中除了对照组以及V9对照组以外，其他组的大鼠分别给予高脂饮食；而V9治疗组以及V9对照组的大鼠分别进行乳双歧杆菌V9灌胃(1x109 CFU)；HFD+Berberine组则给予小檗碱(300mg/kg)。
3.检测方法
实验结束后，采集大鼠血液样本以及肝脏组织样本进行检测。
注：
对照组(Control)
HFD组(HFD)：高脂饮食
HFD+Berberine组：高脂饮食+小檗碱
V9治疗组(HFD/V9)：高脂饮食+乳双歧杆菌V9
V9对照组(CON/V9)：乳双歧杆菌V9
实验结果
1.减轻HFD诱导的肝脏损伤
为了探究乳双歧杆菌V9对HFD所导致肝损伤的缓解作用，通过苏木精—伊红染色法在组织学水平上检测了肝损伤的发展。发现高脂饮食长达6周后，肝脏组织出现明显损伤，小叶结构紊乱，肝细胞肥大，出现严重的脂肪变性（大量脂质液滴形成）。相比之下，经过乳双歧杆菌V9和小檗碱治疗可明显改善肝小叶结构减轻肝脂肪变性（图1a）。与HFD组相比，乳双歧杆菌V9和小檗碱治疗均可显著降低血清中丙氨酸转氨酶(ALT)以及天冬氨酸转氨酶(AST)水平（图1b，c）。这表明乳双歧杆菌V9可以减轻高脂肪饮食所引起的肝损伤以及脂肪变性。
图1:a为经HE染色后肝脏组织切片；b为ALT水平；c为AST水平
2.改善HFD诱导的脂质和葡萄糖代谢紊乱
HFD组的甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平升高，而V9治疗组和HFD+Berberine组的TG和FFA水平降低（图2a，b）。此外，经过乳双歧杆菌V9和小檗碱的治疗可以使HFD诱导的肝糖原含量降低（图2c）。与HFD组相比，补充乳双歧杆菌V9还可以显著降低总胆固醇(TC)和空腹血糖水平（图2d）。这表明乳双歧杆菌V9可以改善脂质和葡萄糖的代谢紊乱。
图2:a为甘油三酯(TG)水平；b为游离脂肪酸(FFA)水平；c为肝糖原水平；d为空腹血糖水平
3.逆转涉及脂质和葡萄糖代谢相关基因的失调
对参与了脂质和葡萄糖代谢调节的关键信号通路进行评估发现，HFD诱导大鼠固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA表达增加，随后经过乳双歧杆菌V9和小檗碱的处理而降低（图3a，b）。肝脏中PPAR-ɑ的mRNA表达因HFD的攻击而受到显著下降，并通过乳双歧杆菌V9处理得以恢复，而小檗碱处理其水平并没有显著变化。与对照组相比，V9对照组的PPAR-ɑ的mRNA表达增加（图3c）。经过蛋白质印迹分析，经过乳双歧杆菌V9和小檗碱处理可以恢复磷酸化AMPK的表达（图3d）。
图3:a为SREBP-1c的mRNA表达详情；b为FAS的mRNA表达详情；c为肝脏中PPAR-ɑ的mRNA表达详情；d为蛋白质印迹分析
4.减少HFD诱导的原发性反应
探究乳双歧杆菌V9的抗炎作用，测定了肝脏mRNA水平以及血清TNF-α，IL-1β和IL-6的水平。与对照组相比，HFD刺激导致血清TNF-α，IL-1β和IL-6的水平显著增加，这些细胞因子的mRNA表达也是如此。而乳双歧杆菌V9可以显著抑制HFD诱导的mRNA和相关蛋白质的表达，在小檗碱中也发现了相似的趋势（图4a-f）。这表明乳双歧杆菌V9和小檗碱均可降低HFD诱导的炎症细胞因子水平。
图4:相关炎症细胞因子的mRNA表达详情
5.抑制TLR和NLRP3的表达
图5a和b所示，与对照组相比，HFD组的TLR4和TLR9的mRNA表达显著增加，而乳双歧杆菌V9和小檗碱可以降低其表达。同时在V9治疗组和HFD+Berberine组中发现NLRP3和ASC的mRNA表达显著下降（图5c，d）。
图5:乳双歧杆菌V9对肝脏TLRs、NLRP3和ASC的影响
6.抑制AMPK，AKT和NF-κB激活
为了进一步评估乳双歧杆菌V9对HFD诱导的NAFLD保护机制，继续评估TLR介导的下游信号通路变化。HFD诱导可导致JNK、ERK和AKT磷酸化升高，同时乳双歧杆菌V9和小檗碱可以降低其激活。乳双歧杆菌V9还可以抑制NF-κB磷酸化。这表明乳双歧杆菌V9抑制AMPK，AKT和NF-κB的激活将有助于抗炎症作用。
实验结论
乳双歧杆菌V9可以减轻非酒精性脂肪肝大鼠的肝脂肪变性以及氨基化，减轻因高脂饮食诱导的肝脏组织损伤以及脂肪变性。调节相关代谢，改善脂质水平以及葡萄糖含量。同时发现乳双歧杆菌V9还具有显著的抗炎作用，减少细胞炎症因子的表达。通过抑制AMPK，TLR和NF-κB信号通路抑制氨基转移，从而改善NAFLD。
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