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基因编辑大牛张锋出手!1小时可快检新冠病毒

时间:2020-02-16 13:24

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导读:2月14日,CRISPR基因编辑大神 张锋 教授团队发布了使用基于 CRISPR/Cas13 的 SHERLOCK 技术 检测新型冠状病毒的详细操作流程文档 。 protocol详见文末 原文阅读 。 文档中的测试表明, SHERLOC...

2月14日,CRISPR基因编辑大神张锋教授团队发布了使用基于CRISPR/Cas13SHERLOCK技术检测新型冠状病毒的详细操作流程文档。 protocol详见文末“原文阅读” 。

文档中的测试表明,SHERLOCK技术检测新冠病毒异常灵敏, 每微升里仅10-100个病毒拷贝,都可以被检测出来。而且,该方法操作简单, 仅需纯化的核酸分子样本,通过简单的三步,1个小时内即可完成检测

此外,张锋强调,由于他们无法获取新型冠状病毒患者样本,因此无法使用真实的患者样本来验证这一技术。同时,他们欢迎有新型冠状病毒肺炎(COVID-19)样本的研究人员联系,可以免费提供用于检测的试剂盒

张锋 表示,希望该protocol可以为有兴趣进一步开发该诊断系统的研究人员提供参考,也欢迎研究人员与之联系以寻求帮助或指导

SHERLOCK技术由张锋团队于2017年发明,此后在拉沙热埃博拉寨卡病毒登革热等RNA病毒疫情检测中大显身手。

Cas13 是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA。 世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒 (例如 埃博拉病毒、 艾滋病病毒 , 流感病毒、SARS病毒 等 )此次在武汉爆发的 新型冠状病毒 ,同样是RNA病毒 。

张锋团队,针对此次新型冠状病毒,设计了两个向导RNA(gRNA) ,分别用于识别新冠病毒的S基因Orf1ab基因

为最大化提高检测特异性和准确率,设计的向导RNA以最大程度减少对人类呼吸系统相关病毒的脱靶性。

这样,一旦检测样本中含有新型冠状病毒,向导RNA就会识别到它的S基因Orf1ab基因,进而引导Cas13切割这两个病毒基因。通过让被切割的RNA形成条带,形成视觉可见的结果,清晰直观展示病毒检测结果。

2019年底,武汉市出现因新型冠状病毒感染导致的肺炎疫情,截至2月15日上午,全国已有超过6.6万人感染,并造成超过1500人死亡。

疫情爆发初期,用于确诊的 real-time PCR检测试剂盒 供应不足,导致许多疑似病例迟迟不能确诊。

近期检测试剂盒供应量上来后,不少案例发现,试剂盒检测为阴性的,实际已经感染新冠病毒,而且, real-time PCR检测耗时长、操作复杂,难以满足快速增长的疑似病例排查需求。

对于武汉此次爆发的急性病毒性疫情来说,检测试剂盒的灵敏性检测速度价格操作简便性等缺一不可。

SHERLOCK技术的发明

CRISPR/Cas系统 是细菌和古菌特有的免疫系统,是生命进化历史上,细菌和病毒进行斗争产生的免疫武器,用于抵抗病毒或外源性质粒的侵害。当外源基因入侵时,该防御系统的 CRISPR 序列会表达与入侵基因组序列相识别的 RNA,然后 CRISPR 相关蛋白 (Cas,一种核酸内切酶) 在序列识别处切割外源基因组DNA,从而达到防御目的。

CRISPR技术是在20世纪90年代初发现的,2013年2月15日, 张锋 等人将CRISPR/Cas9系统成功应用于哺乳动物和人类细胞的基因编辑,此后迅速成为人类生物学、农业和微生物学等领域最流行的基因编辑工具。

根据效应核酸酶组成的亚基数量,CRISPR/Cas系统可以分为两类:第一类系统的核酸酶由多个亚基组成;第二类系统特别受关注,其核酸酶由单一的蛋白组成,包括基于Cas9、Cas12和Cas13效应蛋白的II、V和VI型。其中,与大多数Cas蛋白不同,Ⅵ型系统的核酸酶Cas13是一种依赖于RNA靶向的RNA核酸酶,专一的切割RNA,不切割DNA,在分子诊断方面具有重要的应用价值

世界上许多最常见或致命的人类病原体都是RNA病毒 (例如埃博拉病毒寨卡病毒艾滋病病毒流感病毒等)此次在武汉爆发的 新型冠状病毒,同样是RNA病毒 。

2017年4月, CRISPR基因编辑大牛 张锋 ,在 Science 杂志发表论文, 发明了基于CRISPR/Cas13的病毒检测技术 。

张锋将这种检测技术命名为—— SHERLOCK ,这一与神探夏洛克·福尔摩斯同名的检测技术,可以让被切割的RNA形成条带,形成视觉可见的线索,并直观展示出来。

SHERLOCK(specifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking)

相比于传统的real-time PCR检测, SHERLOCK检测技术准确度更高,而且价格和检测所需时间也减少了一半 。

张锋,CRISPR领域的奠基人之一,最早将CRISPR应用于哺乳动物和人类细胞

SHERLOCK大显身手

2018年,非洲尼日利亚爆发拉沙病毒,张锋所在的Broad研究所与尼日尼亚展开合作,使用SHERLOCK检测技术检测拉沙病毒。由于尼日利亚经常发生断电,而聚合酶链式反应(PCR)检测对电力依赖强,而SHERLOCK对于断电不像PCR对断电那么敏感,再加上SHERLOCK成本更低,时间更快,大大提高了病毒检测效率。据估计,SHERLOCK检测技术的应用,帮助减少了对尼日利亚拉沙病毒60%的死亡率。

Jennifer Doudna:CRISPR领域的奠基人之一

此外,CRISPR基因编辑奠基人 Jennifer Doudna 和她在伯克利的团队也开发了基于CRISPR/Cas12a的检测技术,用于检测人乳头瘤病毒(HPV)病毒。Jennifer Doudna希望这一检测工具 能够帮助遏制宫颈癌死亡人数的上升,对于发展中国家和非洲等地的国家,疾病通常被诊断发现时已经太晚。

南美洲国家 洪都拉斯 和美国加州的科学家正在测试针对登革热病毒、 寨卡病毒 和与癌症相关的人乳头瘤病毒(HPV)毒株的CRISPR检测诊断。

2018年,非洲刚果民主共和国爆发新的埃博拉疫情,张锋的同事、SHERLOCK检测技术的负责人、Broad研究所研究员 Parson Sabeti 第一时间对来自感染者的病毒样本进行了测序,从DNA数据中清楚确定了病毒传播的途径。参与这项工作的许多科学家在这次疫情中感染死亡,但换回了更多生命。她因此被评为《时代周刊》2014年度人物,当之无愧的“ 埃博拉斗士 ”。

非洲刚果民主共和国也正在进行一项针对埃博拉病毒的CRISPR检测的探索性研究。

特别值得一提的是,Jennifer Doudna团队和张锋团队之间虽然 正在进行的激烈的专利争夺战。但双方均表示, 他们致力于授权CRISPR检测工具,以便需要这些诊断的人可以使用它们 。

SHERLOCK还能消灭病毒

2019年10月10日,麻省理工学院和哈佛大学Broad研究所的 Pardis C. Sabeti 、 张锋等人在Cell 子刊 Molecular Cell 杂志发表了题为: Programmable Inhibition and Detection of RNA Viruses Using Cas13 的研究论文。

Parson Sabeti 、张锋等 将Cas13的抗病毒活性与其诊断能力结合起来,建立了一个强大和快速可编程的诊断和抗病毒系统 ,命名为 CARVER (Cas13辅助的病毒表达和读出限制) , 以检测和消灭人类细胞中基于RNA的病毒 。该系统将来可能用于诊断和治疗病毒感染 (包括由新病毒和新兴病毒引起的感染) 。

注:CARVERCas13-assisted restriction of viral expression and readout,同时,CARVER也有雕刻师的意思

研究人员通过实验测试了Cas13在分别感染了三种不同RNA病毒的人类细胞中的活性: 淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒 (LCMV) 、 甲型流感病毒 (IAV) 和疱疹性口炎病毒 (VSV) 。研究人员将Cas13基因片段和一种工程化的引导RNA导入细胞,24小时后,将细胞暴露在病毒中。再过24小时后,Cas13酶使细胞培养中的病毒RNA水平降低了多达40倍

研究小组进一步研究了Cas13对病毒感染性的影响——换句话说,剩余的病毒有多少可以继续感染人类细胞。数据表明, 在病毒暴露8小时后,Cas13将流感病毒的传染性降低了300多倍 

为了增加诊断需求,研究人员还采用了基于Cas13的核酸检测技术 SHERLOCK (specifichigh-sensitivity enzymatic reporter unlocking) 。这个三合一的CARVER系统可以快速测量样品中病毒RNA的剩余水平。

这项研究表明,基于CRISPR/Cas13的基因编辑工具, 不仅能用于病毒的快速检测诊断,还能用于清除病毒,治疗病毒引起的疾病 。

国内相关研究情况

2018年3月12日,中科院上海植物生理生态研究所 王金 博士等在 Cell Research 杂志上发表了题为: CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA 的研究论文。

该研究深入系统地研究了Cas12a对于靶标ssDNA和非靶标ssDNA的切割特性。表明 Cas12a可用于对单链DNA病毒的快速检测 。

值得一提的是,该研究论文投稿时间比Jennifer Doudna团队的类似研究论文投稿时间更早,这也说明我国在CRISPR领域已经达到国际领先水平。

结语

对于大多数传染病来说,诊断需要专业的知识,先进的设备和充足的电力 ,而这些要求在许多爆发疫情的地方都达不到。

对于快速爆发的病毒性疫情,快速检测和确诊现得尤为重要,早一分一秒,就意味着更早一些控制疫情蔓延,减少人员伤亡。

目前正在使用的real-time PCR检测技术虽然在新冠病例确诊和疑似病例排查中发挥了重要作用,但是受操作复杂耗时长需集中送检等限制,不能满足当前快速增长的大量疑似患者、无症状感染者的排查诊断需求。

基于CRISPR的病毒检测工具提供了与传统方法一样、甚至更高的诊断准确率,并且非常简单易操作,检测所需时间也缩短一半。

参考内容:

https://doi.org/10.1016/j.molcel.2019.09.013

https://doi.org/10.1126/science.aam9321

https://doi.org/10.1038/s41422-018-0022-x

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