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乳双歧杆菌V9减轻大鼠肝脂肪变性和氨基化

时间:2020-10-05 15:25

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作者:admin

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导读:非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为一种慢性肝病,主要是在无酒精消耗情况下肝脏中发生脂肪沉积或变性现象,在脂肪沉积、氧化应激以及肝脏慢性炎症的作用下,NAFLD可能会发展为非酒精...
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为一种慢性肝病,主要是在无酒精消耗情况下肝脏中发生脂肪沉积或变性现象,在脂肪沉积、氧化应激以及肝脏慢性炎症的作用下,NAFLD可能会发展为非酒精性脂肪性肝炎(NASH),还可能发展为肝硬化。高脂饮食以及缺乏运动是患NAFLD的主要病因,改变生活方式及减肥可缓解NAFLD,同时有越来越多的研究表明,肠道微生物可以参与肝脏中相关因子的代谢;双歧杆菌与蓝莓同食可以减轻NAFLD大鼠脂肪的沉积。故本实验建立高脂饮食(HFD)大鼠模型,探究乳双歧杆菌V9对NAFLD的缓解作用。

  实验设计

  实验详情

  1.实验对象

  选取40只健康大鼠作为实验材料进行为期4周的实验,随机分为五组,分别为:对照组、HFD组、HFD+Berberine组、V9治疗组(HFD/V9)和V9对照组(CON/V9),每组各8只大鼠。

  2.实验方法

  其中除了对照组以及V9对照组以外,其他组的大鼠分别给予高脂饮食;而V9治疗组以及V9对照组的大鼠分别进行乳双歧杆菌V9灌胃(1x
109 CFU);HFD+Berberine组则给予小檗碱(300mg/kg)。

  3.检测方法

  实验结束后,采集大鼠血液样本以及肝脏组织样本进行检测。

注:

对照组(Control)

HFD组(HFD):高脂饮食

HFD+Berberine组:高脂饮食+小檗碱

V9治疗组(HFD/V9):高脂饮食+乳双歧杆菌V9

V9对照组(CON/V9):乳双歧杆菌V9

  实验结果

  1.减轻HFD诱导的肝脏损伤

  为了探究乳双歧杆菌V9对HFD所导致肝损伤的缓解作用,通过苏木精—伊红染色法在组织学水平上检测了肝损伤的发展。发现高脂饮食长达6周后,肝脏组织出现明显损伤,小叶结构紊乱,肝细胞肥大,出现严重的脂肪变性(大量脂质液滴形成)。相比之下,经过乳双歧杆菌V9和小檗碱治疗可明显改善肝小叶结构减轻肝脂肪变性(图1a)。与HFD组相比,乳双歧杆菌V9和小檗碱治疗均可显著降低血清中丙氨酸转氨酶(ALT)以及天冬氨酸转氨酶(AST)水平(图1b,c)。这表明乳双歧杆菌V9可以减轻高脂肪饮食所引起的肝损伤以及脂肪变性。


乳双歧杆菌V9减轻大鼠肝脂肪变性和氨基化
图1:a为经HE染色后肝脏组织切片;b为ALT水平;c为AST水平

  2.改善HFD诱导的脂质和葡萄糖代谢紊乱

  HFD组的甘油三酯(TG)和游离脂肪酸(FFA)水平升高,而V9治疗组和HFD+Berberine组的TG和FFA水平降低(图2a,b)。此外,经过乳双歧杆菌V9和小檗碱的治疗可以使HFD诱导的肝糖原含量降低(图2c)。与HFD组相比,补充乳双歧杆菌V9还可以显著降低总胆固醇(TC)和空腹血糖水平(图2d)。这表明乳双歧杆菌V9可以改善脂质和葡萄糖的代谢紊乱。
乳双歧杆菌V9减轻大鼠肝脂肪变性和氨基化
图2:a为甘油三酯(TG)水平;b为游离脂肪酸(FFA)水平;c为肝糖原水平;d为空腹血糖水平


  3.逆转涉及脂质和葡萄糖代谢相关基因的失调

  对参与了脂质和葡萄糖代谢调节的关键信号通路进行评估发现,HFD诱导大鼠固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和脂肪酸合成酶(FAS)的mRNA表达增加,随后经过乳双歧杆菌V9和小檗碱的处理而降低(图3a,b)。肝脏中PPAR-ɑ的mRNA表达因HFD的攻击而受到显著下降,并通过乳双歧杆菌V9处理得以恢复,而小檗碱处理其水平并没有显著变化。与对照组相比,V9对照组的PPAR-ɑ的mRNA表达增加(图3c)。经过蛋白质印迹分析,经过乳双歧杆菌V9和小檗碱处理可以恢复磷酸化AMPK的表达(图3d)。
乳双歧杆菌V9减轻大鼠肝脂肪变性和氨基化
图3:a为SREBP-1c的mRNA表达详情;b为FAS的mRNA表达详情;c为肝脏中PPAR-ɑ的mRNA表达详情;d为蛋白质印迹分析

  4.减少HFD诱导的原发性反应

  探究乳双歧杆菌V9的抗炎作用,测定了肝脏mRNA水平以及血清TNF-α,IL-1β和IL-6的水平。与对照组相比,HFD刺激导致血清TNF-α,IL-1β和IL-6的水平显著增加,这些细胞因子的mRNA表达也是如此。而乳双歧杆菌V9可以显著抑制HFD诱导的mRNA和相关蛋白质的表达,在小檗碱中也发现了相似的趋势(图4a-f)。这表明乳双歧杆菌V9和小檗碱均可降低HFD诱导的炎症细胞因子水平。

乳双歧杆菌V9减轻大鼠肝脂肪变性和氨基化
图4:相关炎症细胞因子的mRNA表达详情
 
  5.抑制TLR和NLRP3的表达

  图5a和b所示,与对照组相比,HFD组的TLR4和TLR9的mRNA表达显著增加,而乳双歧杆菌V9和小檗碱可以降低其表达。同时在V9治疗组和HFD+Berberine组中发现NLRP3和ASC的mRNA表达显著下降(图5c,d)。

乳双歧杆菌V9减轻大鼠肝脂肪变性和氨基化
图5:乳双歧杆菌V9对肝脏TLRs、NLRP3和ASC的影响

  6.抑制AMPK,AKT和NF-κB激活

  为了进一步评估乳双歧杆菌V9对HFD诱导的NAFLD保护机制,继续评估TLR介导的下游信号通路变化。HFD诱导可导致JNK、ERK和AKT磷酸化升高,同时乳双歧杆菌V9和小檗碱可以降低其激活。乳双歧杆菌V9还可以抑制NF-κB磷酸化。这表明乳双歧杆菌V9抑制AMPK,AKT和NF-κB的激活将有助于抗炎症作用。

  实验结论

  乳双歧杆菌V9可以减轻非酒精性脂肪肝大鼠的肝脂肪变性以及氨基化,减轻因高脂饮食诱导的肝脏组织损伤以及脂肪变性。调节相关代谢,改善脂质水平以及葡萄糖含量。同时发现乳双歧杆菌V9还具有显著的抗炎作用,减少细胞炎症因子的表达。通过抑制AMPK,TLR和NF-κB信号通路抑制氨基转移,从而改善NAFLD。


 
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